碱基切除修复(base excision repair,BER)是DNA修复途径的一种,可以保护生物体的基因组免受内在因素和环境的损害,在维持基因组完整性中发挥关键作用。DNA糖基化酶可以将N-糖苷键从受损碱基和DNA骨架之间切断,从而激活BER修复途径。当DNA糖基化酶的活性异常时,就可能导致多种人类疾病甚至癌症,因此,对DNA糖基化酶的活性进行检测,有助于深入了解受损DNA的修复过程,进行临床诊断和药物研发。量子点(quantum dots,QDs)的激发光谱较宽、发射光谱较窄、荧光寿命比较长、量子产率高,具有优良的光稳定性和独特的光电性质,经常作为荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的供体。因此基于单量子点的FRET纳米传感器具有信噪比高、灵敏度高、样品消耗低、检测时间快的显著优势,广泛应用于生化分析检测领域。本论文中,我们基于以量子点为供体的FRET原理,结合等温核酸扩增技术和单分子检测技术,构建了两种用于检测DNA糖基化酶活性的纳米传感器,逐渐简化了实验流程,大大提高了检测效率。具体内容如下:1、人单链选择性单功能尿嘧啶DNA糖基化酶1(human single-stranded selective monofunctional uracil DNA glycosylase 1,h SMUG1)是尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil DNA glycosylase,UDG)超家族中一个重要的亚家族成员,可以切除尿嘧啶和嘧啶的氧化衍生物以维护基因组的完整性和稳定性。我们熟知的多种人类疾病都与h SMUG1活性的异常密切相关,然而,由于对h SMUG1催化机理的认识还不够深入,目前用于h SMUG1活性检测的方法比较少。本论文中,我们首次使用5-羟甲基尿嘧啶(5-hydroxymethyluracil,5hm U)作为h SMUG1的新型特异性催化位点,构建了一种可编程链置换驱动组装的单量子点纳米传感器,可以在单细胞水平准确检测h SMUG1活性。当h SMUG1存在时,它能够催化切除5hm U,进而激活后续的指数式链置换级联反应,从而产生大量引物探针;随后,引物探针与生物素标记的捕获探针以及Cy5标记的报告探针结合,形成三明治杂交结构(即引物探针/生物素标记的捕获探针/Cy5标记的报告探针)的双链DNA(double-stranded DNA,ds DNA);该三明治杂交结构可以自组装到605QD的表面,形成605QD-ds DNA-Cy5的纳米结构,进而诱导高效的FRET。通过单分子成像就可以对FRET信号进行量化。由于h SMUG1催化切除5hm U反应的高特异性、指数式链置换级联反应的高扩增效率、605QD-ds DNA-Cy5纳米结构引发的高FRET效率和单分子检测的超高信噪比,该方法对h SMUG1的检测限(limit of detection,LOD)为7.08×10~(-11) U/μL,线性范围为1.00×10~(-10)U/μL～0.01 U/μMK-2206研究购买L,跨越8个数量级。此外,该单量子点纳米传感器具有分析酶动力学、筛选h SMUG1酶活性抑制剂、区分h SMUG1在癌细胞和正常细胞之间的表达差异和在单细胞水平检测癌细胞内源性h SMUG1活性的能力,在与h SMUG1相关的生物学研究、生物医学和生物分析应用领域都具有较大的潜力。2、人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(human alkyladenine DNA glycosylase,h AAG)是一种单功能的DNA糖基化酶,能识别许多烷基化和脱氨基的嘌呤病变,并将其切除以启动碱基切除DNA修复途径,其活性失调与人类多种疾病相关。为了检测低丰度的h AAG,科研工作者已经发展了一系列基于QD的FRET方法,用来放大检测信号。然而,这些方法通常使用额外的生物素标记的捕获探针与信号探针形成激活FRET所必需的ds DNA结构,这种刚性的ds DNA结构可能会限制QD和能量受体之间的能量传递效率。在此基础上,我们构建了一种双功能单链DNA(single-stranded DNA,ss DNA)信号探DNA Purification针组装的单量子点纳米传感器,可以灵敏地检测h AAG活性。在该纳米传感器中,我们设计了一种三功能的发夹探针,简化了检测过程,并结合了单分子检测技术,以提高该传感器的检测灵敏度。当h AAG存在时,它可以催化发夹探针裂解,进而引发后续的链置换扩增(strand displacement amplification,SDA)反应,产生大量的生物素和多个Cy5荧光分子标记的ss DNA信号探针。由此产生的带有多个受体的信号探针可以组装到605QD表面,形成605QD-ss DNA-Cy5的纳米结构,诱导从605QD到Cy5的高效FRET。产生的FRET信号可以通过单分子成像来检测。该纳米AZD6738研究购买传感器仅需1 h就可完成对h AAG的活性检测,LOD为3.60×10~(-10) U/μL,线性范围为6个数量级(1.00×10~(-9) U/μL～1.00×10~(-3) U/μL),可定量测定单个癌细胞里的h AAG活性。