CRISPR/Cas9基因编辑系统来源于细菌及古细菌的获得性免疫系统,可在sg RNA引导下高效的靶向目的序列。然而,原本Cas9为避免自身免疫的对于前间隔序列临近基序(Protospacer adjacent motif,PAM)的识别机制却极大的限制了CRISPR/Cas9系统的靶向范围。2020年,基于结构导向性工程SAHA方法所构建的两种SpCas9变体,SpG和SpRY通过降低PAM偏好性显著提高了CRISPR/Cas9系统的靶向范围。其中,SpG可高效识别NGN PAM,可高效识别基因组中占20.45%的NGN PAM;SpRY可高效识别基因组中占比为50.01%的NRN PAM(R为A或G),并对基因组中占比为49.99%的NYN PAM(Y为C或T)有一定识别效率,几乎不受PAM偏好性限制。利用SpG和SpRY构建的BE系统可有效靶向原有碱基编辑器无法靶向的具有非经典PAM的位点,具有更高的通用性。但此前两系统仅在细胞系、植物和斑马鱼等平台上得到了证实,尚未有构建基因编辑哺乳动物的报道。家兔是经典的哺乳动物模型,对其进行基因编辑构建疾病模型对生物医学研究具有重大意义。利用原有BE系统已获得了许多成功模拟人类致病性点突变的家兔疾病模型。然而,在构建点突变家兔模型时,原有BE系统Cas9蛋白严格的PAM偏好性使得许多位点无法被靶向编辑,SpG和SpRY的出现有望解决这一问题。首先,为研究SpG系统对家兔胚胎的编辑效果,本研究在家兔胚胎中选取了6个NGN位点检测了SpG-BE4max与SpG-ABEmax的编辑效果,并使用了NG-Cas9这一早期构建的、识别NGN PAM的Cas9变体作为对照。在对于Tyrp.R285X,Dmd-p.Q785X和Mstn-p.C313Y三个位点的编辑中,SpG-BE4max介导C→T编辑效率介于50%～87.5%之间,平均编辑频率为43.4～91.1%,显著优于NG-BE4max(编辑效率30～50%,平均突变频率8.0～76.0%)。在Sod1-p.I151T和Lmna-p.L530P两位点,SpG-ABEmax介导靶点目标碱基A→G突变的编辑效率为36.4～92.3%,平均编辑频率为70.8～90.9%,编辑效果显著优于NG-ABEmax(仅Sod1-p.I151T存在44.4%个编辑效率,平均突变频率56.5%,在Lmna-p.L530P无效率)。在验证胚胎编辑效果的基础上,为进一步确定SpG在模型构建中的高效性与准确性。本研究利用SpG-ABEmax构建了Sod1-p.I151T突变介导的肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)疾病模型兔。全部F0个体均携带了目的突变,所有个体中突变频率高达81.0～97.0%,且未检出非预期突变。通过步态分析、肌电图和组织学研究证明了Sod1-p.I151T突变ALS模型兔存在步长缩短、纤颤、异常运动单元电位、肌肉萎缩和神经元死亡等表型,符合人类ALS患者中典型的运动机能障碍、失神经支配与神经再支配、肌肉萎缩和神经退行性变化等临床表征。基于模型对致病机制的探讨则进一步阐明了Sod1-p.I151T突变通过介导细胞内质网应激导致细胞凋亡的分子病理学机制。尽管相较原有SpCas9,SpG具有更高靶向范围,但其仍无法识别NCN、NTN和NAN等非经典PAM。而基于SpG所构建的SpRY进一步提高了PAM兼容性。为研究SpRY系统对家兔胚胎的编辑效果,本研究中为SpRY-BE4max和SpRY-ABEmax各选取了4个非经典PAM位点进行编辑效果的检测。SpRYBE4max在Arpp21-p.P529L,Kcnj11-p.F333F,Kcnj11-p.H186H和Gck-p.R186X四个位点的平均编辑效率为66.7～100.0%,靶向介导C→T突变的平均频率为52.5～89.0%。SpRY-ABEmax在Anxa11-p.D40G,Kcnj11-p.Y335C,Kcnj11-p.H259R和Kcnj11-p.I296V四个位点的平均编辑效率为50.0～80.0%,靶向介导A→G突变的平均频率为31.4～94.1%。说明SpRY系统在家兔胚胎中对非经典PAM位点具有高效的靶向性。为进一步检测SpRY系统在模型构建中的效果,本研究利用SpRY-ABEmax对Kcnj11-p.H259R,Kcnj11-p.I296V两个非经典NGG PAM位点进行双位点共打靶构建先天性高Breast cancer genetic counseling胰岛素血症(Congenital Hyperinsulinism,CHI)模型兔。实验结果表明获得的所有F0个体均携带两个目的突变,其中Kcnj11-p.H259R位点突变频率为42.0～82.0%,Kcnj11-p.I296V位点的突变频率为46.0～97.0%。基因型分析显示SpRY-ABEmax未造成非预期突变。CHI模型兔表现出空腹血糖降低、血清胰岛素水平上升和胰腺胰岛素沉积等人类CHI典型临床表征,精确模拟了人类KCNJ11功能丧失型突变导致的CHI。综上,本研究检测了SpG系统在家兔胚胎中NGN PAM位点的编辑效果,证明其相对旧有NG-Cas9系统的高效性,并首次利用该系统构建了ALS家兔模型。这是NVP-TNKS656体内实验剂量最早利用SpG系统构建的哺乳动物模型之一,也是已报道的首个基因编辑家兔神经退行性疾病模型。该模型成功模拟了人类ALS典型的临床表征和完整的病理变化过程,相较原有药物诱导模型具有更高的精确性,可作为未来ALS致病机制探究和进行诊疗手段临床前实验的良好平台。本研究还进一步测试了基于SpG发展而来的几乎无PAM偏好性限制的SpRY系统在家兔胚胎中的编辑效果,并首次利用该系统构建了CHI模型兔。对于SpG和SpRY系统的应用极大拓宽了构建基因编辑家兔时可选位点的范围,丰富了可构建模型的类型,为未来大规模构建人类疾病的家兔模型提供了理论与技术支持。