随着慢性肾功能不全发病率在全球范围内逐年增高,终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)已经成为严重影响公众健康的社会问题。据统计,我国现有超过100万名终末期肾病患者,其治疗的主要方法为血液Custom Antibody Services透析和肾脏移植。尽管近年来技术进步较大,血液透析患者的死亡率仍然很高;而肾移植肾源紧缺是当前难题,且肾脏移植存在免疫排斥反应,需终生治疗。为突破肾脏替代治疗的局限性,肾脏再生成为研究热点。随着干细胞技术与再生医学的发展,应用干细胞进行肾脏再生为终末期肾病患者带来新的希望。当前,肾脏类器官作为肾脏再生研究方向之一,获得了广泛关注。它利用模拟体内肾脏发育过程,通过控制Wnt等多个信号通路,以干细胞等作为种子细胞,经历自原条到肾祖细胞各个分化阶段后构建的3D细胞团组织。然而,现有的肾脏类器官普遍存在缺乏血管灌注系统、结构不成熟等问题,仍不足以应用于再生领域,而血管化则是突破这些局限的重要因素。本研究拟利用人多能干细胞为种子细胞,构建出类肾器官,通过体内移植、体外血管化等手段,以获得血管化程度更高、结构更成熟的类肾。第一部分通过单肾切除小鼠肾被膜下移植类肾促进血管化及结构成熟目的诱导人多能干细胞(Human pluripotentSB431542抑制剂 stem cells,hPSCs)来源的类肾体,探讨类肾体内移植后的血管化、结构成熟度和非肾系分化现象。方法1.以hPSCs为种子细胞通过肾上皮分化试剂盒诱导成类肾,用HE染色观察类肾管状结构,应用免疫荧光检测类肾中足细胞特异性标志物WT1和PODXL、近端小管特异性标志物LTL和远端小管特异性标志物CDH1的表达。应用透射电镜(TEM)观察类肾中足细胞和肾小管的超微结构。2.建立单肾切除小鼠模型,类肾在体外诱导到D15,取4-6周SCID小鼠,切除左侧肾脏。将D15类肾移植于小鼠右肾包膜下。3.移植2-4周后,取小鼠右肾及类肾标本进行大体观察、HE染色、免疫荧光鉴定和TEM检测。(1)selleck HPLC肉眼观察移植类肾的体积与血管分布;(2)HE染色观察类肾的肾小球、肾小管、血管化和非肾系结构;(3)免疫荧光检测足细胞标志物WT1、远端小管标志物CDH1、特异性小鼠内皮细胞标志物MECA-32、内皮细胞标志物CD31、人源性特异性标志物人抗核抗原HNA、干性标志物NANOG。(4)TEM观察类肾中肾小球、肾小管、血管和红细胞的超微结构。4.移植12周,取类肾标本进行大体观察、HE和Masson染色、免疫荧光检测。(1)肉眼观察移植12周类肾的体积和血管化;(2)HE和Masson染色观察移植物的肾小球、肾小管和非肾系结构;(3)免疫荧光检测移植物远曲小管标志物CDH1和足细胞标志物WT1的表达。结果1.体外诱导的类肾,HE染色发现类肾大量管状结构;免疫荧光显示肾脏特异性标志物WT1、PODXL、LTL和CDH1均呈阳性表达;TEM观察到类肾不成熟的足细胞和肾小管结构。2.类肾移植2-4周鉴定(1)移植2-4周的类肾,肉眼观察类肾体积增大,移植物表面可观察到多条小血管。(2)移植2-4周的类肾,HE染色观察到肾小球样结构、肾小管状结构和大量类软骨结构,肾小球和类肾基质内观察到大量红细胞。随移植时间延长,类肾血管化更丰富,同时类软骨成分也增多。(3)移植4周的类肾,免疫荧光观察到WT1在肾小球样结构中呈阳性表达,CDH1在管状结构细胞中呈阳性表达,血管内皮细胞分子标记物CD31在移植物中呈阳性表达;MECA-32阳性细胞散在分布于移植组织和肾小球结构中,提示移植物的血管化,其血管内皮细胞可能部分是宿主来源。人源性特异性抗体HNA在移植物中呈阳性表达,证实移植物系hPSCs来源。移植物干性标志物NANOG呈阳性表达,提示移植4周后,移植物仍具有分化干性。(4)移植4周的类肾,TEM观察到类肾器官成熟的证据,包括肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)、有孔内皮、足细胞裂孔及毛细血管等超微结构。TEM也观察到成熟肾小管超微结构,包括单层上皮细胞紧密连接、管周毛细血管网、开放的肾小管管腔和上皮细胞的极化,以及肾小管上皮细胞特征性线粒体和微绒毛。3.类肾移植12周鉴定(1)移植12周后,移植物体积较移植2-4周继续增大,在移植物表面仍可观察到血管结构。(2)HE染色和Masson染色观察移植物类软骨结构消失,出现大量间充质组织,肾小球结构消失,仅观察到零散的管状结构。(3)免疫荧光发现CDH1在散在管状结构中阳性表达,WT1在移植物中未观察到阳性表达。结论以hPSCs为种子细胞可在体外诱导出结构幼稚的类肾。类肾在体内环境下,可通过嵌合宿主血管促进血管化,同时移植物可在体内环境下发育成熟。长期移植,非肾系组织将取代肾元组织。第二部分通过hPSCs诱导血管内皮细胞促进类肾血管化目的利用hPSCs为种子细胞,在体外诱导类肾器官和类血管。通过优化诱导条件,将hPSCs来源的类肾器官与类血管共培养,构建出血管成分更丰富的类肾器官。方法1.以hPSCs为种子细胞通过肾上皮分化试剂盒诱导成类肾。免疫荧光检测肾脏特异性标志物WT1、PODXL、LTL和CDH1,血管内皮细胞标志物CD31和UEA-1,以及血管平滑肌标志物α-SMA。2.以hPSCs为种子细胞诱导成类血管。流式细胞检测类血管中血管内皮细胞(CD31+CD144+)纯度;免疫荧光检测类血管中血管内皮细胞标志物VECAD和血管平滑肌标志物α-SMA,内皮细胞标志物CD31和UEA-1,以及周细胞标志物 PDGFR-β。3.Day7的肾祖细胞与内皮细胞共培养11天。RT-qPCR分析类肾类血管共培养体中肾脏特定基因表达;免疫荧光检测类肾类血管共培养体中血管内皮细胞标志物CDH1、微管乙酰化标志物Acetylated-tubulin、血管内皮标志物VECAD和足细胞标志物PODXL的表达。4.免疫荧光对比类肾类血管共培养体与单独类肾中VECAD和PODXL表达的差异。结果1.类肾检测:免疫荧光显示CD31和UEA-1在类肾中均呈阳性表达,说明类肾体分化过程中会产生血管内皮结构。血管平滑肌标志物a-SMA呈阳性表达,提示类肾中产生血管平滑肌成分。2.类血管检测:免疫荧光显示类血管中VECAD、CD31和UEA-1均呈阳性表达,说明类血管包含血管内皮成分。α-SMA表达呈阴性,说明分化得到了较纯的血管内皮细胞,未生成动脉平滑肌成分。在类血管中检测到PDGFR-β呈阳性表达,提示类血管中生成周细胞成分。流式检测细胞显示类血管细胞传代第三代血管内皮细胞(CD31+CD144+)占比约95%以上。3.类肾类血管共培养检测:光镜能够观察到分化结构明显的肾小管结构。RT-qPCR分析类肾类血管共培养体中均检测到肾脏特定基因的表达。免疫荧光检测CDH1和Acetylated-tubulin呈阳性,提示共培养体中生成肾小管结构。VECAD和PODX均呈阳性表达,提示共培养体中生成足细胞成分和血管内皮细胞成分。4.单独类肾与类肾类血管血管化对比:类肾类血管共培养体中VECAD阳性表达细胞明显多于单独类肾;提示类肾类血管共培养体较类肾生成了更多的血管内皮细胞成分。结论通过hPSCs为种子细胞,可以诱导出类肾和类血管。在诱导类肾的过程中,加入hPSCs来源的类血管共同诱导,可以获得血管成分更丰富的类肾。