冰岛刺参内脏(Cucumaria frondosa viscera)是冰岛刺参加工中的主要副产品,因其丰富的蛋白质和多糖含量,被认为在食品加工中具有广阔的前景。本文以冰岛刺参内脏为主要试验材料,研究了冰岛刺参内脏蛋白质的提取,冰岛刺参抗氧化肽的制备及工艺条件优化,并采用超滤分离纯化冰岛刺参抗氧化肽,研究了不同分子量冰岛刺参抗氧RP56976作用化肽的活性,验证了抗氧化肽超滤组分对H_2O_2诱导的PC12细胞氧化损伤的保护作用,主要结果如下。(1)比较不同提取方式对冰岛刺参内脏蛋白提取的影响,确定超声波辅助提取作为本试验冰岛刺参内脏蛋白质的提取方法,Citric acid medium response protein其蛋白质提取率和纯度分别为70.05±0.95%和74.95±1.25%;利用单因素和响应面优化冰岛刺参内脏蛋白的提取工艺及参数,在料液比1:41 g/m L、p H值11.2、温度57.6℃、功率80 W的条件下超声提取38 min,蛋白质提取率可达82.87±0.12%。SDS-PAGE结果显示,冰岛刺参内脏蛋白主要由分子量150 k Da、45 k Da和12 k Da的蛋白质组成。氨基酸分析结果表明,冰岛刺参内脏蛋白含有17种氨基酸,具有作为抗氧化肽来源的潜力。(2)筛选多种蛋白酶应用于冰岛刺参内脏蛋白的酶解研究,确定复合蛋白酶为最佳水解用酶,利用单因素和响应面优化冰岛刺参抗氧化肽的制备工艺,在底物质量分数4.4%、加酶量4887 U/g、p H值7.0、温度56℃的条件下水解4.2 h,酶解产物的DPPH自由基清除率高达89.18±0.11%。酶解产物的分子量分布和氨基酸组成分析表明,冰岛刺参抗氧化肽<1 k Da的组分占85.01%,<500 Da的组分占71.39%,其中,以小分子肽为主;酸性和疏水性氨基酸分别占总氨基酸的29.68%和40.27%,因此,冰岛刺参抗氧化肽呈现出较强的抗氧化活性与其较低的分子量分布和氨基酸组成密不可分。(3)采用超滤分离纯化冰岛刺参抗氧化肽,得到五种多肽组分C1(>10 k Da)、C2(5～10 k Da)、C3(3～5 k Da)、C4(1～3 k Da)和C5(<1 k Da),通过单因素试验对超滤条件进行优化,得出最佳超滤分离的条件为:p H值7.0、温度25℃、压力0.15 Mpa、切向流速6 LMH。抗氧化活性研究结果表明,冰岛刺参抗氧化肽C5组分的抗氧化能力是所有组分中最强Bucladesine的,具有明显的自由基清除活性、Fe~(2+)螯合能力和还原力,其DPPH、ABTS、羟基自由基清除率和Fe~(2+)螯合率IC50值分别为0.397 mg/m L、0.161 mg/m L、0.209 mg/m L和0.159 mg/m L;此外,与其他组分相比,C2组分的Fe~(2+)螯合能力最为突出,IC50值为0.189 mg/m L。(4)建立H_2O_2诱导的PC12细胞体外氧化应激模型,研究冰岛刺参抗氧化肽超滤组分C5对PC12细胞氧化损伤的保护作用。结果表明,冰岛刺参抗氧化肽超滤组分C5(10～1500μg/m L)对PC12细胞无毒性影响;确定H_2O_2在500μM的浓度下,诱导PC12细胞4 h建立氧化损伤模型;确定超滤组分C5低、中、高剂量的浓度分别为25μg/m L、50μg/m L、100μg/m L,而阳性对照组VC的终浓度为200μg/m L;超滤组分C5能够明显降低氧化损伤PC12细胞内ROS水平和MDA含量,减少LDH释放量,维护细胞膜结构及完整性,增强细胞内SOD、GSH-Px和CAT的活性,提高其抵抗氧化损伤的功能,且在100μg/m L时效果最好。