研究目的:重复闭合性脑损伤(repeated closed head injury,r CHI)是对抗类项目运动员常见的脑损伤之一,经常发生在拳击、足球、橄榄球等对抗性比赛和其他运动中,运动过程中严重的闭合性脑损伤会造成不可逆性的颅脑器质及功能异常,给运动人员带来了极大的身体和心理伤害,是临床亟待解决的难题。闭合性脑损伤对神经等损害主要包括两方面,首先是直接性伤害,包括神经元轴突或者突触的损伤等。其次是继发性伤害导致的闭合性脑损伤,由于线粒体结构和功能障碍、细胞碎片等导致的氧化应激和慢性炎症反应可导致脑组织受到二次伤害。因此,解决重复闭合性脑损伤后的继发性伤害是促进脑损伤恢复的一种有前景的治疗策略。靶向线粒体结构和功能进而改善多种损伤性脑病和神经退行性脑病已得到大量研究的证实。目前普遍认为线粒体是低强度激光的光生物调节作用(Photobiomodulation,PBM)的靶点,光生物调节可通过改善线粒体功能影响氧化应激和炎症反应进而达到到减轻脑损伤的目的。然而,鲜有研究深入探讨PBM预防r CHI的作用和神经保护的机制。本课题使用大鼠r CHI模型模拟对抗类运动项目常见闭合性脑损伤,探究PBM预防r CHI神经元损伤和行为学障碍的作用和机制。研究方法:将32只6周龄雄性SD大鼠,随机分为4组。分别为正常对照组(Cont组)、正常对照+光生物调节组(Cont+PBM组)、脑损伤组(r CHI组)、脑损伤+光生物调节组(r CHI+PBM组),每组8只。使用自由落击模型构建闭合性脑损伤,每5天进行一次撞击,共撞击3次。术前使用异氟烷对大鼠进行麻醉,备皮,碘伏局部消毒后在颅骨正中做3 cm左右切口,剥离皮下组织及骨膜,充分暴露颅骨,置于十字型撞杆下,使用198.6 g圆柱形撞击器在120 cm高处自由落击大鼠头部切口处。撞击后立即去除撞击器,缝合局部皮下组织及皮肤,局部应用抗生素以防止伤口感染。造模后Cont+PBM组和r CHI+PBM组即刻进行808 nm连续获悉更多波低强度激光照射头部损伤处,每天照射一次,每次2 min,连续20天。头皮表面接受到的激光强度为350 mW/cm2、皮质接受到的激光强度为25 mW/cm2、光斑面积为1.5 cm2。Cont组和r CHI组非激光照射,但进行与光生物调节组同样的操作,唯一不同的是不打开激光器电源。实验进行至第20天,使用巴恩斯迷宫(Barnes maze)、高架十字迷宫(Elevated plus maze)、旷场实验测试检测大鼠脑损伤后的焦虑、紧张等状态。免疫荧光和/或Western Blot检测皮质的神经元凋亡(NeuN/Tunel,Caspase-3/9的活性、Bcl-2、Bax)、神经元退行性变化(NeuN/Fluoro-Jade C)、神经元损伤(MAP2、MBP、SYP、Spin)、线粒体碎片化(Tom20、FIS1、MFN1)、星形胶质细胞和小胶质细胞的过度活化及表型极化(GFA购买CobimetinibP和Iba-1分别与A1/M1和A2/M2标记物分别进行共染)、检测不同极化表型的星形胶质细胞对髓鞘的吞噬情况(GFAP、A1/A2标记物及MBP进行三染)。使用Image J和ImariHIV-related medical mistrust and PrEPs软件进行共定位分析及细胞体积分析。研究结果:巴恩斯迷宫结果显示,重复闭合性脑损伤不会导致海马依赖的空间学习及记忆障碍,r CHI组与r CHI+PBM组之间无显著性差异;高架十字迷宫发现r CHI组进入开臂的次数和总体逗留时间显著低于Cont组和r CHI+PBM组,提示重复闭合性脑损伤造成大鼠的焦虑样行为,而PBM显著改善r CHI造成的大鼠焦虑样行为。旷场实验进一步验证了r CHI组大鼠的焦虑样行为,主要表现为穿越线的次数显著低于Cont组和Cont+PBM组。Tunel染色结果显示,r CHI造成皮质部位的神经元发生明显的凋亡,而PBM显著减少重复闭合性脑损伤造成的神经元凋亡;NeuN与Fluoro-Jade C共染发现r CHI造成神经元明显的退行性变化,而PBM显著改善神经元退行性变化;MAP2、MBP、Spin、SYP的染色结果发现,PBM可显著改善r CHI导致的神经元损伤。进一步的机制研究发现,PBM可通过改善线粒体的碎片化减少炎症反应,表现为r CHI组皮质区域线粒体连续结构显著减少、分裂蛋白表达显著增加、融合蛋白表达显著减少、小胶质细胞和星形胶质细胞显著激活,而光生物调节作用干预后上述变化均得到显著改善。重复闭合性脑损伤导致星形胶质细胞向A1表型极化,导致A1表型星形胶质细胞吞噬髓鞘,而PBM则促使极化的星形胶质细胞向抗炎表型A2极化并减少髓鞘吞噬。Cont组和Cont+PBM组之间在行为学和上述各指标的统计中无显著性差异。研究结论:低强度激光光生物调节作用可显著改善重复闭合性脑损伤导致的神经元损伤、神经元退行性变化和神经元凋亡。机制上主要通过减少线粒体碎片化进而调控胶质细胞的表型极化状态,减少星形胶质细胞对神经元髓鞘的吞噬。同时结果表明光生物调节对正常大鼠皮质调控无效。上述结果为在运动医学领域使用低强度PBM调节预防和减少对抗类项目中的重复闭合性脑损伤提供了有力的动物实验支持。