抗生素在临床医学和畜禽养殖业中的大量使用与细菌耐药性的增加已形成一种恶性循环,导致多重耐药菌的产生和流行。碳青霉烯类药物是治疗多重耐药菌感染最重要的抗生素,但多种革兰氏阴性菌如假单胞菌(Pseudomonas)已对其产生耐药性。Pseudomonas是环境中常见的条件致病菌,其中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)可导致呼吸机相关肺炎和囊性纤维化等多种疾病,严重威胁人类健康。Pseudomonas通过分泌碳青霉烯酶水解相应的药物,这类耐药基因往往都是由可移动元件携带,通过基因的水平转移扩大传播范围,加快传播速度,同时新型抗生素研发缓慢,使得治疗该菌感染的难度加大。为此,研究人员提出抗生素协同剂的治疗策略,该策略可提高抗生素对耐药菌感染的治疗效果,降低抗生素的开发成本。食物中提取的天然化合物具有毒副作用小,不易诱导细菌耐药,可以长期食用等优势,将其开发为抗生素协同剂对于耐药菌的防治具有重要意义。本研究鉴定了 40株耐碳青霉烯假单胞菌(carbapenem-resistant Pseudomonas,CRP)对20种抗生素的敏感性,通过二代、三代测序技术相结合的方法获得细菌的遗传序列信息,对携带碳青霉烯酶基因的外源遗传元件(accessory genetic elements,AGEs)内部的精细结构及进化关系进行解析,探讨其在介导耐药基因传播过程中所发挥的作用,并从484种药食同源中药单体化合物中发掘新型碳青霉烯类药物协同剂,探究其作用机制。主要内容及结果如下:以分离自吉林省的40株CRP菌株为试验对象,采用BD Phoenix~(TM) 100微生物全自动分析仪鉴定菌株的物种信息及其对20种抗生素的耐受性,利用二代高通量测序技术对菌株进行测序并获得细菌基因组框架图,通过生物信息学对菌种进行精确鉴定,筛查其携带的耐药基因情况,通过系统发育树分析菌株的变异情况及遗传进化关系。结果表明,共鉴定到39株耐碳青霉烯铜绿假单胞菌(carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa,CRPA)和 1 株耐碳青霉烯P.juntendi菌株(carbapenem-resistant PseudINCB018424omonas juntendi,CRPJ),对其中13种受试抗生素的耐药率大于95%,IP对3株CRPA的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)为 4,096 μg/mL。使用耐药基因数据库 ResFinder 和 CARD对40株CRP进行筛查,共发现27种外源耐药基因,有6株菌携带3种外源碳青霉烯酶基因(bla_(IMP-1)、bla_(KPC-2)和bla_(VIM-2)),有3株菌同时携带bla_(KPC-2)和bla_(VIM-2)。使用毒力基因数据库VFDB对39株CRPA进行筛查,90%以上的菌株含有T3SS分泌蛋白基因exoY和exoT,85%的菌株含有外毒素蛋白基因exoA,本研究中携带外源碳青霉烯酶基因的分离株未筛查到携带exoA基因;使用PAst及pbMLST数据库对其进行筛查,共获得9种血清型及17种STs分型,不存在多重耐药血清型及大流行克隆群,但鉴定得到1株新ST型的临床CRPA分离株。系统发育树表明,分离株CRPJ 18091276与美国和巴西鉴定的菌株遗传距离较近,携带同种外源碳青霉烯酶基因的CRPA是在同一祖先的基础上进化而来。利用三代高通量测序技术对携带bla_(IMP-1)的CRPJ 18091276和CRPA 18083286以及同时携带bla_(KPC-2)和bla_(VIM-2)的CRPA 18102011进行全基因组测序并获得完整的染色体和质粒序列,通过生物信息学和比较基因组学对携带碳青霉烯酶基因的AGEs内部的精细结构进行注释并与同家族元件进行比较,判断遗传进化机制,采用接合转移试验鉴定分离菌株携带的外源碳青霉烯酶基因水平转移能力。结果表明,携带bla_(IMP-1)的CRPJ 18091276通过ICE1276捕获intI1-bla_(IMP-1)结构重组于res结合位点IΔTn4662a下游,捕获基因盒aacA4’形成In1886,通过Tn402转座模块中的res结合位点r1重组形成P.aeruginosa PA1 5W质粒中的结构(inntI1-bla_(IMP-1)-aacA4′-tniR-ISCfr1-aac(3)-IId-strB-strA-tniQ-tniB-tniA);CRPA 18083286通过Tn7转座子Tn6411捕获携带bla_(IMP-1)的In992具有碳青霉烯类药物抗性,该元件的Tn402样转座模块截断,导致In992无法移动,稳定存在于Tn6411中。bla_(VIM-2)以基因盒的形式被In2057捕获,重组于CRPA 18102011携带的IncpRBL16型巨质粒pP2011-1内部,通过同家族质粒结构对比,发现该家族质粒除已有的21个重组位点外,又形成3个新的重组位点(orf852、orf477及orf432),umuC是该家族质粒稳定的重组位点。该质粒通过新型整合子In2057捕获MBLs基因bla_(VIM-2),重组于orf477外源插入区,赋予细菌水解IP能力的同时有一定抵抗酶抑制剂的能力。bla_(KPC-2)由ΔISKpn6和ISKpn27所构成的复合转座子捕获,重组于CRPA 18102011携带的IncP6型泛宿主质粒pP2011-2内部。携带碳青霉烯酶基因的AGEs中,仅IncP6型和IncpRBL16型质粒可以通过接合转移的方式将bla_(KPC-2)和bla_(VIM-2)水平转移至大肠埃希氏菌(Escherichia coli DH5α中,接合转移效率均为 10-6。通过棋盘法最小抑菌浓度试验从484种药食同源中药单体化合物中优选出与碳青霉烯类药物亚胺培南(imipenem,IP)具有协同作用的2″-O-没食子酰基金丝桃苷(2″-O-galloylhyperin,HyG);通过细菌生长曲线及时间-杀菌曲线判断食源性协同剂与IP联Biomimetic bioreactor合作用下对耐药菌的抑制效果;采用头孢硝噻吩试验及转录组测序技术判断食源性协同剂的作用机制。结果表明,HyG在8μg/mL的浓度下将IP对CRPA 18102011及其接合子E.coli D201 1 的 MIC 值由 4,096 μg/mL 降至 1,024 μg/mL(FICI<0.5),与 IP 呈现协同作用。HyG在4 μg/mL的浓度下可将IP对携带bla_(KPC-2)的K.pneumonia 2445的MIC值由128μg/mL下降至64 μg/mL,该协同疗法对携带其它类型碳青霉烯酶的受试菌未见杀菌活性。细菌生长曲线和时间-杀菌曲线结果表明HyG在8 μg/mL浓度下对耐药菌的生长无影响并能够显著增强IP的杀菌活性,转录组测序显示该化合物对受试菌的染色体及质粒呈现多位点调控作用,通过基因本体(gene ontology,GO)富集分析发现,导致CRPA耐药性降低的主要原因是对其氧化还原过程中部分基因进行负反馈调节以增加细菌中活性氧自由基(radical oxygen species,ROS)的含量。该购买Lorlatinib化合物还对IncP6型质粒复制基因repA的表达显著抑制。通过观察头孢硝噻吩试验中颜色变化,该药物对repAIncP6下游的bla_(KPC-2)的表达具有抑制作用,但不如酶抑制剂阿维巴坦抑制效果显著。综合以上结果,在吉林省来源的40株CRP中鉴定到3种不同的外源碳青霉烯酶基因bla_(IMP-1)、bla_(VIM-2)以及bla_(KPC-2),这些基因的获得方式以整合子捕获为主,并存在一株菌同时携带多种碳青霉烯酶基因的情况。鉴定得到1株CRPA菌株携带IncpRBL16型巨质粒,该质粒的分子结构呈高度多样性及复杂的马赛克特征,大量AGEs的整合有助于耐药基因的累积和分布,提高CRP在药物选择压力下的生存能力,增加由它们引发感染的治疗难度。该质粒可以作为碳青霉烯酶基因的移动载体进一步在不同种细菌间进行水平转移。本研究通过体外试验首次确定了鹿蹄草(Pyrola)中的黄酮类化合物HyG具有作为IP协同剂的潜力,为后续CRPA的耐药机制和缓解耐药性相关研究提供理论依据,为CRPA的感染提供一种新型食源性天然化合物的辅助治疗策略。