研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,占全球新发女性癌症病例的24%以上,约占癌症相关死亡病例的15%。尽管诊断和治疗方法不断发展,但部分乳腺癌患者的预后仍不理想,特别是转移性乳腺癌患者的预后情况。既往研究报道,3%～10%的乳腺癌患者在首诊时即存在远处转移,这部分患者目前认为是不可治愈的,并且,在原发非转移性病例中,最终有25%的患者可出现远处转移。除此之外,先天性和获得性耐药以及肿瘤异质性等问题,也极大地限制了药物治疗的有效性,往往会导致治疗失败和肿瘤进展,缩短患者生存时间。因此,探究乳腺癌耐药转移的分子机制有助于寻找新的治疗策略,从而改善乳腺癌患者的预后。依据先前的一些研究报道,肿瘤治疗过程可以诱导细胞发生特异性程序性细胞死亡。在2012年,铁死亡做为一种新的程序性细胞死亡形式首次被发现。一经发现,便作为一种潜在的肿瘤治疗途径引起了广泛的关注。铁死亡的主要特征是铁依赖的脂质过氧化物积累,其在形态学、生物化学和遗传学上与传统的凋亡、自噬或坏死不同。此前,多种基因己被认定与铁死亡密切相关,这些基因统称为铁死亡相关基因(ferroptosis-related genes,FRGs),如谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、CDGSH铁硫结构域1(CISD1)和核因子E2相关因2(NRF2)等。虽然不同类型的肿瘤细胞对铁死亡的敏感性不同,但铁死亡在肿瘤进展和治疗中起着关键作用,在卵巢癌,肺癌和乳腺癌中研究发现,铁死亡诱导剂(erastin)和化疗药物的联合应用可以提高癌症的疗效。并且,铁死亡也与多种肿瘤的预后相关,有学者在胶质瘤、黑色素瘤和肾细胞癌中建立了铁死亡相关预后模型,进而探索铁死亡相关基因作为肿瘤预后标志物和治疗靶点的潜在价值。许多报道也显示铁死亡与乳腺癌有很强的相关性,这表明铁死亡有望成为乳腺癌的重要生物标志物。因此,建立乳腺癌铁死亡相关预测模型,进一步阐明铁死亡在乳腺癌中的作用机制,将有助于乳腺癌的预后预测和治疗疗效提高,从而进一步改善乳腺癌患者的预后情况。肿瘤免疫微环境通常包括存在于肿瘤周围的免疫细胞和免疫相关分子,这些细胞和分子在肿瘤间质间相互影响,对免疫治疗的反应发挥重要作用。近年来,免疫细胞和免疫分子与铁代谢的关系得到了广泛的关注。多种类型免疫细胞,包括Th1细胞、自然杀伤T细胞和巨噬细胞等,也被证明与铁代谢稳态的维持有关。有趣的是,肿瘤细胞中发生铁死亡,可将更多的肿瘤细胞表面抗原暴露于免疫细胞,这有助于提高免疫治疗的抗肿瘤疗效。然而,铁死亡在乳腺癌免疫治疗中的具体作用及机制尚未完全阐明。在本研究中,首先从GSE20685数据库中获得了乳腺癌患者的mRNA表达谱和临床数据,依此构建了乳腺癌铁死亡相关预后模型。接着,利用METABRIC数据库进一步对该模型进行验证。此外,本研究还通过ssGSEA和免疫浸润分析评估了肿瘤微环境中的免疫浸润特征。第二,基于多个数据库以及乳腺癌组织表达和预后分析,本研究选择了铁死亡相关基因热休克蛋白β-1(HSPB1)进行后续研究,深入探究了 HSPB1在乳腺癌及铁死亡中的作用及调控机制。功能实验证实,HSPB1对乳腺癌的发展及铁死亡起着至关重要的作用。最后,我们进一步揭示了 HSPB1在乳腺癌化疗耐药中的相关功能,发现其能够参与调控化疗诱导的铁死亡。我们的研究强调了铁死亡相关基因HSPB1是乳腺癌化疗耐药的一个新的调节因子,靶向HSPB1可能成为抑制乳腺癌进展和克服治疗耐药的新策略,这将有助于改善乳腺癌患者在接受个体化治疗时的临床获益情况。第一部分 乳腺癌铁死亡相关预后PF-03084014抑制剂预测模型的构建及免疫浸润分析研究目的1.基于铁死亡相关基因的表达情况对乳腺癌患者进行分组,并分析不同乳腺癌患者亚组间的基因表达差异、临床特点及预后情况。2.利用GEO数据库构建乳腺癌患者铁死亡相关预后预测模型,并通过METABRIC数据库进行验证。3.评价基于铁死亡相关基因构建的预后模型的预测价值,并构建nomogram模型。4.分析高风险组及低风险组乳腺癌患者的生存情况、免疫浸润情况、免疫治疗反应的差异。5.评估靶向铁死亡相关基因在乳腺癌治疗中的潜能。研究方法1.基于数据库及文献报道获得铁死亡相关基因,并从GSE20685数据库获得铁死亡相关基因的表达谱及乳腺癌患者的临床信息,利用NMF、t-SNE及PCA分析等对乳腺癌患者进行分组并验证,分析不同乳腺癌患者亚组间的基因表达情况、临床特点及预后情况。2.将GSE20685数据库视为训练集,并将METABRIC数据库视为验证集,利用COX单因素、Lasso及COX多因素回归分析等统计学方法,构建并验证乳腺癌患者铁死亡相关预后预测模型。通过Kaplan-Meier生存分析及ROC分析等评价此预后模型的预测价值。3.通过单因素及多因素COX回归分析,构建nomogram模型,并利用校准曲线、ROC及DCA分析等评价其临床价值。4.利用铁死亡相关预后预测模型将乳腺癌患者分为高风险及低风险两组,通过ESTIMATE、CIBERSORT及ssGSEA算法等分析高风险组和低风险组乳腺癌患者的免疫浸润情况,并通过SubMap分析评价两组患者的免疫治疗反应的差异。5.通过细胞功能实验,评估铁死亡诱导剂在乳腺癌进展中的作用,并通过CellMiner数据库下载获得药物z评分以及NCI-60癌细胞系的相应基因表达情况,从而寻找靶向铁死亡相关基因的潜在治疗药物。研究结果1.从GeneCards数据库、FerrDb数据库及其他相关文献中获得铁死亡相关基因信息,经过整合,纳入314个铁死亡相关基因,经过MAD筛选后,总共171个基因用于后续的亚组分析。NMF分析将乳腺癌患者分为两个亚组(组1和组2),并且t-SNF及PCA分析结果也证实了此分组的准确性。组2患者生存率明显低于组1患者,且两组间在铁死亡相关基因表达及临床特点方面存在较大差异。2.从GSE20685数据库中获得327例乳腺癌患者的铁死亡相关基因的RNA表达和临床信息作为训练集,以METABRIC数据库中的1904例乳腺癌患者的RNA表达和临床信息作为验证集。对GEO的数据进行COX单因素、Lasso及COX多因素回归分析,构建了包含9个铁死亡相关基因的预后预测模型。Kaplan-Meier生存分析结果显示,与低风险组乳腺癌患者相比,高风险组乳腺癌患者的总体生存率明显更低。ROC分析发现,所建立的预后模型在预测乳腺癌总体生存率方面具有显著的特异性和敏感性。利用METABRIC数据库作为验证集,证实了所构建的预后模型的预测效率。3.对9基因预后预测模型及乳腺癌患者临床特点进行单因素和多因素Cox回归分析,结果发现TNM分期和风险评分是乳腺癌总体生存率的独立预测因子,并据此构建了 nomogram模型。校准曲线、ROC及DCA分析等均证实了 nomogram模型的临床价值。4.ESTIMATE算法显示,高风险组乳腺癌患者肿瘤组织具有更高的肿瘤纯度和更低的免疫评分。CIBERSORT算法发现,高风险组乳腺癌患者具有较高的免疫抑制微环境。ssGSEA分析显示,高风险组乳腺癌患者肿瘤组织中的免疫细胞浸润比例普遍较低。SubMap分析发现,低风险组的乳腺癌患者可能在抗PD-1治疗中获益。5.细胞功能实验显示,铁死亡诱导剂可诱导ROS产生并抑制乳腺癌细胞增殖、活性、迁移及耐药性。数据库分析表明,靶向铁死亡相关基因可能在乳腺癌治疗中发挥重要的作用。研究结论1.利用铁死亡相关基因的表达谱,可以将乳腺癌患者分为两个亚组,两组间具有不同的铁死亡基因表达模式、TNM分期及预后情况。2.基于9个铁死亡相关基因的表达,构建了乳腺癌预后预测模型并进行了验证。3.9个铁死亡相关基因预后预测模型在预测乳腺癌患者总体生存率方面具有显著的特异性和敏感性。4.根据构建的预后预测模型,可将乳腺癌患者分为高风险和低风险组,两组间患者预后情况、免疫浸润模式及免疫治疗反应存在较大差异。5.铁死亡诱导剂在抑制乳腺癌耐药转移中发挥重要作用,靶向铁死亡相关基因有望成为乳腺癌治疗的新策略。第二部分 乳腺癌铁死亡相关基因HSPB1的筛选及功能研究研究目的1.筛选乳腺癌中的关键铁死亡相关基因。2.分析铁死亡相关基因HSPB1在乳腺癌组织及正常组织中的表达情况及其与预后的相关性。3.通过体外实验探究HSPB1对乳腺癌细胞的增殖、转移、耐药及铁死亡的作用。4.通过体内实验探究HSPB1对乳腺癌耐药转移的影响。研究方法1.对第一部分中9个铁死亡相关基因进一步筛选,根据TCGA和GEO数据库的层次聚类分析,以及免疫组化和qRT-PCR检测乳腺癌和正常组织样本的差异表达基因,筛选得到乳腺癌铁死亡相关基因HSPB1。随后,运用Kaplan-Meier分析、卡方检验、单因素和多因素的Cox回归分析,探究HSPB1与乳腺癌的预后和临床特点的相关性。2.构建HSPB1过表达载体和siRNA,在过表达或敲低HSPB1的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系中进行以下体外实验:细胞增殖、克隆形成、EdU结合等实验,探究HSPB1对乳腺癌细胞增殖能力的影响;划痕实验、迁移和侵袭实验、Western blot等实验探究HSPB1对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响;IC50检测和细胞毒性试验等评价HSPB1对乳腺癌细胞阿霉素(doxorubicin)耐药的作用;活性氧(ROS)分析、丙二醛(MDA)测定等实验检测HSPB1对乳腺癌细胞铁死亡的影响。3.进一步用裸鼠异种移植模型在体内评估了 HSPB1对乳腺癌的影响。将HSPB1稳定过表达或对照的MDA-MB-231细胞皮下注射到BALB/c裸鼠的右侧胁腹,当皮下肿瘤达到50 mm3大小时,将每组裸鼠随机平均分为两个小组,分别静脉注射doxorubicin或等体积的溶剂对照。一定时间后处死小鼠并取瘤进行IHC分析相关基因表达。此外,利用肺转移模型研究了 HSPB1对乳腺癌体内转移的影响,用苏木精和伊红(H&E)染色比较肺部转移结节的大小和数量。研究结果1.TCGA和GEO数据库的层次聚类分析、患者组织样本显示HSPB1在乳腺癌组织中的表达高于正常组织。此外,HSPB1在乳腺癌细胞系中的表达比正常细胞更高。Kaplan-Meier分析显示,HSPB1高表达的乳腺癌患者的总生存期和无病生存期更差。卡方检验结果表明,HSPB1高表达与乳腺癌的远处转移显著相关(P<0.001)。单变immune senescence量和多变量的Cox回归分析表明HSPB1高表达预示着乳腺癌患者的不良预后。2.在过表达或敲低HSPB1的MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系中进行的一系列体外实验表明,HSPB1过表达促进了乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。HSPB1过表达导致上皮标志物(E-cadherin)表达减少,间质标志物(Fibronectin、N-cadherin、Vimentin)表达增加,证实HSPB1对调节乳腺癌细胞EMT具有显著作用。在doxorubicin耐药的乳腺癌细胞中,HSPB1的mRNA和蛋白表达水平显著高于亲代细胞,doxorubicin处理导致HSPB1的表达以剂量和时间依赖的方式增加,而且HSPB1具有提高乳腺癌细胞doxorubicin耐药的作用。Erastin(铁死亡的诱导剂)处理也会导致HSPB1表达水平以剂量依赖的方式增加,HSPB1的过表达使乳腺癌细胞中erastin诱导的铁死亡水平降低,而ferrostatin-1(Fer-1,铁死亡的抑制剂)的处理则与HSPB1的过表达具有协同效应。因此,ROS及MDA分析均表明,HSPB1有抑制乳腺癌细胞铁死亡的作用。3.裸鼠异种移植模型结果发现,HSPB1过表达导致肿瘤体积和肿瘤重量增加。注射doxorubicin的小鼠肿瘤比PBS处理的肿瘤小而轻,表明doxorubicin对体内乳腺癌细胞的生长有抑制作用。IHC分析表明,在体内HSPB1可增强乳腺癌对doxorubicin的耐药。此外,肺转移模型发现HSPB1过表达明显增加了肺部转移结节的大小和数量。总之,体内实验结果表明,HSPB1促进了乳腺癌细胞的生长、doxorubicin耐药和体内转移。研究结论1.初步筛选出HSPB1作为乳腺癌关键的铁死亡相关基因。2.HSPB1在乳腺癌组织中的表达明显高于正常组织,并且HSPB1高表达与乳腺癌患者的不良预后相关。3.体外实验证明,HSPB1发挥促癌基因作用,能够促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并可通过抑制铁死亡发生增强乳腺癌细胞对doxorubicin的耐药。4.体内实验证明,HSPB1能够促进乳腺癌的进展和耐药。第三部分 铁死亡相关基因HSPB1通过NF-κB通路促进乳腺癌耐药及转移研究目的1.探究铁死亡相关基因HSPB1对NF-κB信号通路的影响。2.评估NF-κB信号通路在HSPB1介导的乳腺癌耐药转移中的作用。3.分析HSPB1对乳腺癌中巨噬细胞浸润的影响并探索相关机制。4.阐明HSPB1促进乳腺癌细胞对doxorubicin诱导的铁死亡抵抗的内在机制。研究方法1.通过Western blot检测HSPB1对NF-κB信号通路相关分子表达的影响。通过NF-κB报告基因实验、western blot及qRT-PCR等探究HSPB1过表达对NF-κB通路活性的影响。2.利用核质蛋白分离及免疫荧光实验等检测NF-κB表达情况,探究HSPB1表达对NF-κB核转位的影响。Co-IP实验探究HSPB1表达对Ikβ-α和NF-κB之结合的影响。用蛋白酶体抑制剂、溶酶体抑制剂处理乳腺癌细胞,检测HSPB1在调节Ikβ-α的蛋白稳定性方面的作用,探究Ikβ-α是否可被蛋白酶体或溶酶体降解。用蛋白质合成抑制剂处理细胞,以检测Ikβ-α的半衰期。通过Western blot检测细胞中Ikβ-α的泛素化。3.运用NF-κB报告基因实验、western blot及qRT-PCR等,证实敲低Ikβ-α能够激活NF-κB信号通路。利用MTT、克隆形成实验、Edu、transwell、划痕实验、ROS检测等,评估激活NF-κB信号通路是否能减弱HSPB1敲低对乳腺癌的抑制作用。4.通过ELISA实验研究IL6的分泌是否会受到HSPB1的影响。通过细胞迁移实验和HUVECs的小管形成实验,检测IL6对乳腺癌细胞恶性行为的作用。使用CIBERSORT、xCell和quanTIseq算法来评价肿瘤微环境中免疫细胞的浸润水平。利用HSPB1敲低或过表达细胞的培养基的上清液以评估HSPB1是否能调节乳腺癌中巨噬细胞的浸润,在培养基中加入抗IL6中和抗体以验证HSPB1促进巨噬细胞恶性行为是由IL6介导的。研究结果1.HSPB1过表达可导致p-Ikβ-α、NF-κB及其靶基因的蛋白水平上升,Ikβ-α的蛋白表达下降。qRT-PCR和免疫荧光检测也表明Survivin和IL6在HSPB1过表达后表达升高。此外,HSPB1敲低可以抑制NF-κB信号通路的激活。这些数据表明,HSPB1参与了 NF-κB信号通路的活化。2.HSPB1过表达能够促进乳腺癌细胞中NF-κB向核内转位,而HSPB1敲低后,NF-κB向核内转位受到抑制。Co-IP实验证实HSPB1能够与Ikβ-α相互结合。蛋白酶体抑制剂可导致Ikβ-α的表达上调,而且HSPB1过表达明显降低了 Ikβ-α的半衰期,说明HSPB1可以降低Ikβ-α的蛋白稳定性。HSPB1调节乳腺癌细胞中IKβ-α的泛素化,敲低HSPB1降低了 Ikβ-α的泛素化水平。这些发现表明,HSPB1可以通过与Ikβ-α结合而加强Ikβ-α泛素化介导的降解,促进NF-κB从细胞质的NF-KB/Ikβ-α复合物中释放出来,促进NF-κB向核内转位,从而增强NF-κB的活性。3.由NF-κB报告实验和检测NF-κB靶基因的表达证实,HSPB1敲低引起的IKβ-α表达增加和NF-κB活性降低,可以通过敲低Ikβ-α来恢复,表明敲低Ikβ-α能够激活NF-κB信号通路。Ikβ-α敲低可以削弱HSPB1敲低对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。在HSPB1敲低的细胞中,由doxorubicin或erastin诱导的细胞活力的抑制和ROS产生的增多可以通过同时敲低Ikβ-α而逆转。这些结果表明,HSPB1通过影响NF-κB的活性来调节乳腺癌细胞的生物学行为和doxorubicin诱导的铁死亡,恢复NF-κB活性可降低HSPB1敲低在乳腺癌细胞中的抑制作用。4.ELISA检测表明HSPB1敲低导致IL6的分泌减少,而HSPB1过表达则促进IL6的分泌。HSPB1过表达细胞的上清液增加乳腺癌细胞的迁移能力和HUVECs的小管形成能力,而补充IL6中和抗体后在一定程度上减弱这种促进作用。HSPB1的表达水平与M2巨噬细胞的浸润水平、M2/M1的比例呈正相关,而与M1巨噬细胞的浸润水平呈负相关。这些结果显示,HSPB1可以通过调节IL6的表达而促进乳腺癌细胞的恶性行为。研究结论1.铁死亡相关基因HSPB1能够在乳腺癌细胞中促进NF-κB信号通路的激活。2.在乳腺癌细胞中,激活NF-κB信号通路能够恢复因HSPB1敲低产生的抑制作用。3.HSPB1通过促进Ikβ-α的泛素化降解,促使胞质中此网站NF-κB的核转位增加,进而抑制doxorubicin诱导的铁死亡。4.HSPB1能够通过调节IL6的表达及分泌从而促进M2巨噬细胞的浸润。