目的:构建一种乏氧响应的PLX4032价格纳米载体用于结直肠癌的治疗,联合米托蒽醌和柳氮磺吡啶,考察体外诱导铁死亡和免疫原性死亡的能力,以及体外促进DC细胞和CD8+T细胞的活化的情况;同时体内检测肿瘤渗透深度和联合免疫治疗在结直肠癌上的治疗效果并探索免疫治疗和铁死亡的相关机制,为未来的临床结直肠癌的治疗提供一种新的策略。方法:1.将PEG、多巴胺(Dopamine)和偶氮苯-4,4-二羧酸(Azobenzene-4,4′-dicarboxylic acid,AZO)通过酰胺反应获得乏氧敏感的PEG多巴胺衍生物PAD,以及合成无敏感键的对照组PD,通过核磁共振氢谱验证化合物的合成成功;随后将PD和PAD分别与不同比例的铁、米托蒽醌(MTO)和柳氮磺吡啶(SAS)配位反应获得乏氧响应材料PAD@MS及其对照组PD@MS;通过相关实验对所获得的纳米材料的理化特性进行表征,包括水合粒径、电位、透射电镜、药物释放,材料稳定性等。2.在细胞层面上进行验证,分别在常氧和乏氧的情况下测量不同分组在细胞中的摄取、药物毒性、ROS水平,以及铁死亡的一些表征,包括MDA、GSH、NADPH的含量,SLC7A11、PTGS2、FTL1的蛋白表达,添加各类死亡抑制剂的细胞毒性试验和通过透射电镜反应细胞线粒体的形貌。3.检测在常氧和乏氧下不同处理组细胞中损伤相关分子模式(DAMPs)相关指标,包括CRT、HMGB1、ATP,从而验证其诱导肿瘤免疫原性死亡的能力;通过流式检测DC的活化成熟情况,评估不同分组对DC的激活能力,体外检测不同处理后的DC细胞对CD8+T细胞的活化能力。4.在动物水平通过小鼠活体成像仪检测游离药物、材料PD@MS和PAD@MS在小鼠体内不同时间点的分布情况,通过大鼠眼眶取血检测不同对间点药物在大鼠体内代谢情况,并在C57BL/6和BALB/c小鼠上监测MC38和CT26结直肠癌皮下瘤治疗疗效。存在C57BL/6小鼠上建立结直肠癌肝转移原位模型,并通过治疗观察疗效。5.检测治疗后体内淋巴结、血液、肿瘤中相关免疫细胞如CD4+T、CD8+T、Treg、巨噬细胞、DC细胞的数量水平变化,体内实验中小鼠肿瘤内铁死亡相关指标的水平,以及用ELISA检测体内IFN-γ和immediate range of motionTNF-α的分泌情况。结果:1.核磁共振氢谱结果显示化合物合成成功;测得PD@MS和PAD@MS的水合粒径大概为～130nm,电位～-15mv,PDI～0.2;在常温下有着良好的稳定性。用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)模拟乏氧环境,测得材料在乏氧的时候有着更快的药物释放,并且透射电镜也证明了材料在乏氧的时候材料分解的更快这一特性。2.在常氧的情况下,细胞对游离药物M+S的摄取相比于材料组PD@MS和PAD@MS明显增高,考虑是PEG的存在会影响细胞的摄取,在乏氧的时候PAD@MS的摄取明显高于PD@MS,考虑是乏氧的时候乏氧键的断裂使得PEG的脱落,从而减少了抑制摄取的影响。PAD@MS在乏氧条件下有着较高的细胞摄取,可抑制MC38细胞和CT26细胞的增殖,其抗肿瘤作用主要与其成分MTO和SAS有关,Fe3+和MTO可通过增加ROS的产生,SAS可通过抑制GSH的合成,从而引起细胞内氧化还原失衡导致细胞死亡。PAD@MS可通过引起肿瘤细胞发生铁死亡来杀伤肿瘤,可降低细胞膜表面SLC7A11的表达、增加细胞内ROS的产生,降低细胞内GSH和NADPH的含量,从而引起氧化还原失衡,引起脂质过氧化物MDA和蛋白PTGS2表达增高;同时细胞线粒体电镜也有着线粒体膜密度增高,外膜断裂,内膜消失等铁死亡特征。添加各种死亡抑制剂的细胞毒性实验结果显示PAD@MS引起的细胞死亡可被铁死亡抑制剂在一定程度上的逆转,证明PAD@MS可通过引起肿瘤细胞发生铁死亡。肿瘤细胞发生免疫原性死亡的时候会释放点击此处一些免疫原性物质,如CRT、HMGB1、ATP等,这些物质可用来诱导DC细胞的活化成熟。实验结果表明PAD@MS在乏氧条件下引起DAMPs的释放更多,从而更能促进DC细胞的活化成熟。另外乏氧时CD44和CD69在CD8+T细胞表面上的表达显著增高。同时,细胞内和分泌的IFN-γ也显着增加。乏氧PAD@MS组的CD8+T细胞数量也有明显增殖。以上结果都证实了 PAD@MS可以明显提高MC38细胞的免疫原性,通过使DC成熟,进而激活CD8+T细胞的细胞杀伤作用。3.与游离药物组相比,PD@MS组和PAD@MS组均可显著增加药物在血液中的有效药物浓度且在血液中稳定性良好,有利于药物持续递送到肿瘤部位。相比于游离药物在体内的被快速代谢且在肿瘤内蓄积低,PAD@MS组有着很好的肿瘤蓄积能力,并且延长了药物在体内的循环时间,展现出优异的肿瘤内蓄积能力。PAD@MS在体内有着很好的肿瘤渗透能力,可以达到远离血管的深部肿瘤组织,可能是因为PAD@MS在肿瘤乏氧微环境分解成小分子颗粒,从而促进其渗透能力。4.在MC38荷瘤C57BL/6小鼠和CT26荷瘤BALB/c小鼠体内,PAD@MS能有效抑制结直肠癌的生长和延长小鼠的生存期,与α-PD-L1联用后效果显著增强,两者具有协同作用。PAD@MS处理组的小鼠血液、淋巴结和肿瘤中的DC细胞和巨噬细胞比例均有升高,可以通过抗原提呈促进T细胞的活化成熟—同时,巨噬细胞的表型更趋向于杀伤肿瘤的M1表型,可以分泌血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)杀伤肿瘤。DC细胞和巨噬细胞抗原提呈促进了 T细胞的活化成熟,同时也增加了血液、淋巴结和肿瘤中的CD4+T和CD8+T细胞比例,并降低了 Treg T细胞的含量,增强了抗肿瘤免疫应答,使得免疫激活比免疫抑制作用更强,使“冷”肿瘤变成了“热”肿瘤,进而重新编辑了肿瘤微环境。在机制上来说,CD8+T细胞分泌的IFN-γ可以通过降低细胞表面的SLC7A11表达,从而进一步加剧肿瘤细胞内氧化还原失衡进而促进肿瘤细胞发生铁死亡来杀伤肿瘤。PAD@MS治疗后未引起明显的组织器官病理学改变,并且拥有着宽泛的治疗窗,肝肾功能指标均未引起明显改变,可认为其是安全的,有转化价值的纳米药物。结论:具有乏氧响应型的PAD@MS赋予了纳米材料在血液循环中避免被清除并保持完整,通过减少正常组织暴露于铁死亡诱导剂来最大程度地减少副作用。到达肿瘤组织后,PEG响应乏氧肿瘤微环境而与纳米颗粒急剧解离,以促进药物的释放和肿瘤对药物的内吞,粒径减小的材料可帮助药物到达更深部的肿瘤位置。我们构建的PAD@MS纳米材料可以有效的通过诱导肿瘤细胞发生铁死亡和免疫原性死亡,发挥化疗协同免疫激活的作用,当与抗PDL1抗体(α-PD-L1)联合使用时,基于纳米颗粒的铁死亡诱导有效地抑制了肿瘤的生长,并通过增强更强的免疫应答显著延长了荷瘤小鼠的存活时间。目前我们的工作证明了通过肿瘤特异性铁死亡诱导对抗免疫抵抗的可行性,这种简单、可控和可扩展的纳米平台在铁死亡驱动的免疫治疗的临床转化中显示出广阔的潜力。