目的:本实验选用云南省道地药材三七的主要有效成分三七总皂苷(PNS),观察PNS对COPD大鼠肺部炎症病变的影响及对巨噬细胞极化的调控作用,并通过观察PNS对Raw264.7巨噬细胞极化的作用,探讨PNS是否可通过调控巨噬细胞极化,干预COPD肺部炎症病变,为中医对靶点治疗COPD提供理论和实验依据,同时也为临床治疗该疾病提供新的思路。方法:动物实验:采用香烟烟熏联合气管滴注脂多糖的造模方法,复制COPD大鼠模型,造模共计八周。通过观察模型大鼠的行为学、肺功能、肺部病理及肺组织匀浆中炎症因子浓度的变化,判断模型复制是否成功。造模成功隔日烟熏维持病变的同时,每日给予三七总皂苷水溶液灌胃,连续给药共计四周。后进行指标检测:采用小动物麻醉仪对大鼠进行麻醉,使用EMMS用力肺功能检测系统检测大鼠的肺功能指标;HE及Masson染色观察大鼠肺部炎症及胶原纤维沉积病变;ELISA法检测大鼠肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎症因子及TGF-β1、IL-10等抑炎因子的表达水平;免疫荧光技术检测大鼠肺组织中M此网站1型巨噬细胞表面标志物(CD11b~+CD86~+)、M2型巨噬细胞表面标志物(CD11b~+CD206~+)的蛋白表达情况;流式细胞技术检测大鼠肺组织中M1型巨噬细胞(CD11b~+CD86~+)、M2型巨噬细胞(CD11b~+CD206~+)的极化情况;RT-PCR法检测M1型巨噬细胞表面标志物(CD11b~+、CD86~+)、M2型巨噬细胞表面标志物(CD163~+、CD206~+)的mRNA的表达。实验数据采用SPSS26.0软件进行统计学处理,计量资料采用均值±标准差((?)±s)表示。检验方法为单因素方差分析或非参数方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义,P>0.05表示差异无统计学意义。使用Graph Pad Prism9.0制作统计图。细胞实验:选用Raw264.7巨噬细胞观察并验证PNS对巨噬细胞极化的调控作用。以脂多糖(LPS)刺激Raw264.7使其向M1型极化;以白介素-4(IL-4)刺激使其向M2型极化。MTS法测定最佳给药浓度,给药组给予最佳给药浓度的三七总皂苷进行干预。采用ELISA法检测细胞培养液中IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β1的浓度表达变化;RT-PCR法检测M1型巨噬细胞表面标志物(CD86~+、iNOS)、M2型巨噬细胞表面标志物(CD163~+、CD206~+)的mRNA的表达;Western Blot法检测M1型巨噬细胞相关因子(TNF-α、iNOS)、M2型巨噬细胞相关因子(TGF-β1、Arg-1、CD206~+)的蛋白表达水平。实验数据采用SPSS26.0软件进行统计学处理,计量资料采用均值±标准差((?)±s)表示。检验方法为单因素方差分析或非参数方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义,P>0.05表示差异无统计学意义。使用Graph Pad Prism9.0制作统计图。结果:动物实验部分:1.气管滴注脂多糖联合香烟烟熏造模后,模型组大鼠出现体重增长缓慢、毛发干枯、焦黄,并伴有脱落的现象;常有打喷嚏、挠鼻子等行为;HE病理切片及Masson染色结果显示模型组大鼠肺组织中存在大量炎性因子浸润、胶原纤维沉积的情况;肺功能检测结果显示模型组大鼠的肺通气功能(FEV0.5、FVC、FEV0.5/FVC、MMEF数值显著降低)、肺容积功能(RV、TLC、RV/TLC、FRC的数值显著升高)均有不同程度受损,肺功能呈下降状态;上述指标表明模型复制成功。2.从大鼠行为学及体重增长情况来看,空白组大鼠毛发顺滑、富有光泽,体重呈逐步上升状态;相比于空白组,模型组大鼠毛发干枯、焦黄、且易脱落,伴有挠鼻子、打喷嚏等行为,且体重增长缓慢;在给予三七总皂苷干预后,给药组大鼠体重增长速度明显加快,打喷嚏等行为有所减少。3.肺功能结果显示,相比于空白组,模型组大鼠的肺通气功能(FEV0.5、FVC、FEV0.5/FVC、MMEF数值显著降低,p<0.05)及肺容积功能(RV、TLC、RV/TLC、FRC的数值显著升高,p<0.05)均有所下降,在给予三七总皂苷干预后,给药组大鼠的肺通气功能及肺容积功能均有显著提升(p<0.05)。4.HE染色检测大鼠肺组织病理变化,结果显示:空白组大鼠肺泡结构清晰完整,肺泡腔无扩大,支气管上皮完整,粘膜上皮细胞排列整齐,纤毛无损伤脱落,无充血水肿,未见明显渗出。模型组大鼠肺间质充血水肿,肺泡壁见大量炎症细胞如巨噬细胞、中性粒细胞及少量淋巴细胞浸润,粘膜层纤毛倒伏、脱落,支气管上皮脱落。部分肺泡结构消失,融合成肺大泡。各给药组大鼠肺组织炎症浸润情况较模型组减轻,充血水肿情况显著减轻,无明显渗出,气道壁纤毛倒伏、脱落现象明显减轻,肺泡结构基本完整。5.Masson染色检测大鼠肺组织胶原沉积情况,结果显示:相比于空白组,模型组大鼠肺组织中胶原纤维含量显著上升,且差异具有统计学意义(p<0.05),在给予三七总皂苷干预后,各给药组大鼠肺组织中胶原纤维含量呈下降趋势,且以三七总皂苷中剂量组及阳性药物组最为显著(p<0.05)。6.ELISA检测大鼠肺组织匀浆中M1型巨噬细胞分泌因子(促炎因子)及M2型巨噬细胞分泌因子(抑炎因子)水平的表达,结果显示:相比于空白组,模型组大鼠肺组织匀浆中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12的表达显著升高(p<0.05),抑炎因子TGF-β1、IL-10的表达水平显著降低(p<0.05);相比于模型组,各给药组大鼠肺组织匀浆中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12的表达显著降低(p<0.05),抑炎因子TGF-β1、IL-10的表达水平显著升高(p<0.05)。7.免疫荧光检测大鼠肺组织中M1/M2型巨噬细胞的蛋白表达水平,结果显示:相比于空白组,模型组大鼠肺组织中M1型巨噬细胞表面标志物(CD11b~+CD86~+)的蛋白表达水平显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05),M2型巨噬细胞表面标志物(CD11b~+CD206~+)的蛋白表达水平显著降低,且差异具有统计学意义(p<0.05);相比于模型组,给药组大鼠肺组织中M1型巨噬细胞表面标志物(CD11b~+CD86~+)的蛋白表达水平显著降低,且差异具有统计学意义(p<0.05),M2型巨噬细胞表面标志物(CD11b~+CD206~+)的蛋白表达水平显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05)。8.流式细胞术检测大鼠肺组织中M1/M2型巨噬细胞计数水平的表达,结果显示:相比于空白组,模型组大鼠肺组织中M1型巨噬细胞(CD11b~+CD86~+)的细胞计数水平显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05),M2型巨噬细胞(CD11b~+CD206~+)的细胞计数水平显著降低,且差异具有统计学意义(p<0.05);相比于模型组,给药组大鼠肺组织中M1型巨噬细胞(CD11b~+CD86~+)的细胞计数水平显著降低,且差异具有统计学意义(p<0.05),M2型巨噬细胞(CD11b~+CD206~+)的细胞计数水平显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05)。9.RT-PCR法检测M1/M2型巨噬细胞表面标志物的mRNA的表达水平,结果显示:相比于空白组,模型组大鼠肺组织中M1型巨噬细胞表面标志物(CD11b~+、CD86~+)的mRNA表达水平显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05),M2型巨噬细胞表面标志物(CD163~+、CD206~+)的mRNA表达水平显著降低,且差异具有统计学意义(p<0.05);相比于模型组,各给药组大鼠肺组织中M1型巨噬细胞表面标志物(CD11b~+、CD86~+)的mRNA表达水平显著降低,且差异具有统计学意义(p<0.05),M2型巨噬细胞表面标志物(CD163~+、CD206~+)的mRNA表达水平显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05)。细胞实验部分:1.正常培养的Raw264.7在显微镜下呈圆形或椭圆形,呈片状生长,生长状态良好。在分别使用LPS刺激Raw264.7 24小时、IL-4刺激48小时后,细胞形态发生显著改变,细胞呈现长梭形或不规则形,细胞数量减少,细胞培养液中有细胞碎片漂浮。2.经查阅文献及前期实验基础,分别设置0、100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml、500ug/bio-templated synthesisml、600ug/ml,7个PNS给药浓度,采用MTS法测定最佳给药浓度:将细胞分为7组,每组设5个复孔,按照上述浓度给药培养12小时后,加入MTS试剂孵育3小时后在波长490nm处测定吸光度,检测不同浓度的PNS对细胞活性的影响。结果显示,在PNS浓度为200ug/ml时,对细胞活性的影响最小,因此将200ug/ml定为细胞给药浓度。3.M1型巨噬细胞实验结果:3.1 PNS对M1型巨噬细胞培养液中炎症水平表达的影响:用LPS刺激Raw264.7后,相比于空白组细胞,模型组细胞培养液中炎症因子IL-1β、TNF-α的表达水平显著升高,抑炎因子IL-10、TGF-β1的表达水平显著降低,且差异具有统计学意义(p<0.05);相比于模型组细胞,在给予三七总皂苷干预后,细胞上清液中炎症因子IL-1β、TNF-α的表达水平显著降低,抑炎因子IL-10、TGF-β1的表达水平显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05)。3.2 PNS对M1型巨噬细胞表面标志物mRNA表达的影响:相比于空白组细胞,模型组细胞M1型巨噬细胞表面标志物CD86~+、iNOS的mRNA表达水平显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05);相比于模型组细胞,在给予三七总皂苷干预后,给药组细胞M1型巨噬细胞表面标志物CD86~+、iNOS的mRNA表达水平显著降低,M2型巨噬细胞表面标志物CD163~+、CD206~+的mRNA表达水平显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05)。3.3 PNS对M1型巨噬细胞相关因子蛋白表达的影响:相比于空白组细胞,模型www.selleck.cn/products/Dasatinib组细胞M1型巨噬细胞相关因子TNF-α、iNOS的蛋白表达水平显著升高;相比于模型组细胞,在给予三七总皂苷干预后,给药组细胞M1型巨噬细胞相关因子TNF-α、iNOS的蛋白表达水平显著降低。4.M2型巨噬细胞实验结果:4.1 PNS对M2型巨噬细胞培养液中炎症水平表达的影响:用IL-4刺激Raw264.7后,相比于空白组细胞,模型组细胞培养液中抑炎因子TGF-β1、IL-10的表达水平显著升高,炎症因子IL-1β、TNF-α的表达水平显著降低,且差异具有统计学意义(p<0.05);相比于模型组细胞,在给予三七总皂苷干预后,细胞上清液中炎症因子IL-1β、TNF-α的表达水平显著升高,抑炎因子TGF-β1、IL-10的表达水平显著降低,且差异具有统计学意义(p<0.05)。4.2 PNS对M2型巨噬细胞表面标志物mRNA表达的影响:相比于空白组细胞,模型组细胞M2型巨噬细胞表面标志物CD206~+的mRNA表达水平显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.05);相比于模型组细胞,在给予三七总皂苷干预后,给药组细胞M1型巨噬细胞表面标志物CD86~+的mRNA表达水平显著升高,M2型巨噬细胞表面标志物CD206~+的mRNA表达水平显著降低,且差异具有统计学意义(p<0.05)。4.3 PNS对M2型巨噬细胞相关因子蛋白表达的影响:相比于空白组细胞,模型组细胞M2型巨噬细胞相关因子TGF-β1、Arg-1、CD206~+的蛋白表达水平显著升高;相比于模型组细胞,在给予三七总皂苷干预后,给药组细胞M2型巨噬细胞相关因子TGF-β1、Arg-1、CD206~+的蛋白表达水平显著降低。结论:1.三七总皂苷能够改善COPD大鼠肺功能,减轻COPD大鼠肺组织中炎症水平,缓解胶原沉积。2.三七总皂苷通过降低COPD大鼠肺组织中M1型巨噬细胞的表达,及肺部炎症因子的释放,提高M2型巨噬细胞的表达,及肺部抑炎因子的表达水平,促进M1/M2型巨噬细胞的动态平衡,从而减轻肺组织中的炎症水平,缓解COPD的病变进程。