研究背景创伤失血是全球第一大非病死亡因素,更是战场减员的主要原因。研究表明,90%因创伤失血导致的阵亡是可以避免的,院前环境下快速有效的止血措施能显著提高伤员生存率。战创伤主要发生在躯干及“交界部位”(腹股沟区、腋窝、肩带以及颈根部等),创面较深而出血量大。现阶段国内普遍使用的紧急止血敷料包括止血带、绷带、纱布等,对躯干及“交界处”深部创伤的止血效果尚有不足、可能造成二次创伤,不能很好地适应院前环境需要。因此,亟需自主开发一种安全有效的止血敷料。课题组设计并小试生产了一种可用于院前紧急止血的医用止血笔,本课题延续前期研究基础,旨在设计一种能够用于该医用止血笔的填充止血材料。我们的研究有望开发出一种适用于院前环境的紧急止血敷料,弥补现有止血敷料的不足。方法1.纤维素纳米纤维的制备与表征采用TEMPO介导氧化法结合高压均质制备了纤维素纳米纤维(CNFs),并通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、热重分析(TGA)、X射线光电子能谱(XPS)、扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)等手段对所制备的CNFs进行理化性质表征。2.羧甲基壳聚糖/纤维素纳米纤维膨胀海绵的制备及理化性能表征通过EDC/NHS催化酰胺偶联,将CNFs引入CMCS结构中并交联形成羧甲基壳聚糖/纤维素纳米纤维膨胀海绵(CNF-CMCS)。通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、热重分析(TGA)、X射线光电子能谱(XPS)等手段,考察所制备的CNF-CMCS的内部化学结构。进而通过对所制备CNF-CMCS密度、孔隙率、溶胀性、吸水性、保水能力、吸水后应力-应变分析、压缩后吸水膨胀过程的分析,考察了CNF-CMCS的物理和机械特征。3.羧甲基壳聚糖/纤维素纳米纤维膨胀海绵的止血效果评价通过体外凝血时间、全血凝固指数(BCI)、扫描电镜观察样品对红细胞和血小板的黏附与激活,考察了CNF-CMCS的体外促凝血活性。通过小鼠肝穿刺模型、大鼠股静脉穿刺模型初步确定CNF-CMCS在动物水平上的体内止血效果。通过建立大鼠股动脉、股静脉截断模型,进一步评价CNF-CMCS用于深部创伤大出血的止血效果。4.羧甲基壳聚糖/纤维素纳米纤维膨胀海绵的体外抗菌活性评价通过直接接触法和扩散法(抑菌圈法)分别评价CNF-CMCS对常见创面感染菌株大肠埃希菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)的直接杀灭活性和扩散抑菌活性。进一步包载了水溶性模型药物莫匹罗星(Mupirocin),并通过高效液相色谱、抑菌圈试验考察了药物释放率与抗菌活性。5.羧Neuromedin N甲基壳聚糖/纤维素纳米纤维膨胀海绵的生物相容性评价以体外溶血试验考察CNF-CMCS的血液相容性;通过MTT试验、Calcein/PI染色、细胞形态等手段评价CNF-CMCS对小Liproxstatin-1细胞培养鼠成纤维细胞(L929)增殖及形态的影响。进一步通过在大鼠皮下植入CNF-CMCS,观察植入后小鼠的局部炎症反应以评价CNF-CMCS的体内生物相容性。结果1.通过TEMPO介导氧化法结合高压均质成功制备了纤维素纳米纤维(CNFs),所制备的CNFs表面具有丰富的羧酸基团,能在水中良好分散成单根纤维,经计算,该纤维长径比为25.22±5.65,可用于进一步研究。2.通过工艺优化,筛选出了合适的CNF-CMLaduviglusibCS配方,将微量CNFs成功引入CMCS结构中。CNFs的引入显著改善了CNF-CMCS的各项物理和机械特性,所制备的CNF-CMCS具有低密度、高孔隙率、可压缩并在吸水后快速膨胀、保水能力强、机械强度高的特点。特别是CNF-CMCS2和CNF-CMCS3,吸水后仍具备较高的机械强度,符合前期设计预期。3.体外凝血活性实验结果表明,所制备的CNF-CMCS具有较强的体外促凝活性。能显著缩短体外凝血时间、促进红细胞吸附与固定,CNF-CMCS还能有效黏附红细胞与血小板,促进血小板聚集与活化。4.在小鼠肝穿刺模型和大鼠股静脉穿刺模型中,给予CNF-CMCS处理后,小鼠的出血状况得到显著改善,所制备的CNF-CMCS能显著降低出血时间、减少出血量。进一步通过大鼠股动脉、股静脉截断模型评价了CNF-CMCS的止血效果,实验结果证实所制备的CNF-CMCS可显著减少深部创伤出血量,特别是CNF-CMCS2和CNF-CMCS3效果尤为显著。5.体外抗菌实验结果显示CNF-CMCS可有效杀灭与之直接接触的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌,具有广泛的接触抗菌活性,但不具备扩散抑菌活性。CNF-CMCS可作为药物递送载体,包载抗菌药物。我们以莫匹罗星为模型药物进行了载药实验,发现其可快速释放所包载的莫匹罗星,并表现出增强的扩散抑菌活性。CNFs含量对CNF-CMCS/Mupirocin中药物释放有明显影响,适量CNFs有利于莫匹罗星释放与活性作用,CNF-CMCS2/Mupirocin表现出较高的莫匹罗星释放率与抗金黄色葡萄球菌活性。6.体内外生物相容性评价结果表明,CNF-CMCS具有优异的体外血液相容性;对L929细胞增殖及形态无明显影响,具有良好的细胞相容性。体内大鼠宿主实验表明,在植入12 h后,CNF-CMCS未引起明显的炎症反应;在植入72 h后,CNF-CMCS2及CNF-CMCS3只引起了少量中性粒细胞聚集和浸润,说明该海绵具有良好的组织相容性。结论1.通过EDC/NHS催化酰胺偶联将CNFs引入CMCS海绵,成功筛选制备出了CNF-CMCS。所制备CNF-CMCS保水性强、可被压缩并快速吸水膨胀,符合止血海绵进入伤口后快速吸血膨胀并对伤口周围持续施加压力以产生压迫止血效果的预期。特别是CNF-CMCS2和CNF-CMCS3,吸水后仍具备较高的机械强度,可作为后续研究理想的候选材料。2.体内外实验证实了CNF-CMCS具有良好的促凝血活性、可显著减少出血时间和出血量,止血效果确切。CNF-CMCS2及CNF-CMCS3对深部创伤出血止血效果良好,具有在深部创伤止血领域的应用前景,达到了医用止血笔填充材料的预期要求。3.体外抗菌实验证实CNF-CMCS具有良好的直接接触抗菌活性,但不具备扩散抑菌效果。包载水溶性药物莫匹罗星后,可快速释放,获得显著增强的扩散抑菌活性。4.体内外生物相容性研究发现,CNF-CMCS具有良好的生物相容性。综上所述,所研制的CNF-CMCS止血效果确切、生物相容性良好、具有广泛的抗菌活性、可包载药物、对深部创伤止血效果较好,符合研究设计作为医用止血笔填充材料的预期要求,有较好的转化及应用前景。